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腺相關病毒載體基因治療產品的色譜分析策略
來源:沃特世 | 作者:沃特世 | 發布時間: 2023-08-10 | 93 次瀏覽 | 分享到:
隨著AAV在臨床上的應用越來越廣泛,了解它的質量屬性對產品療效和安全性的影響變得很有必要。目前用于表征AAV的分析技術也有很多,其中包含離子交換色譜(IEX)、體積排阻色譜(SEC)、反相液相色譜(RPLC)和親水作用色譜(HILIC)等的色譜方法被越來越多地應用起來。以下是四種表征AAV的色譜分析策略分享。

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  • Protein-Pak Hi Res Q, 5 μm, 4.6×100 mm(部件號:186004931


圖1. 在Protein-Pak Hi Res Q?譜柱上分離AAV8空?殼和完整?殼混合物。20 mM Tris pH 9,NaCl在20 min內從 0增加?300 mM,流速0.4 mL/min。a?c)進樣6 μL。a) 260 nm處的TUV。b) 280 nm處的TUV。c)熒光檢測:激 發波?280 nm,發射波?350 nm。d)進樣0.5 μL的熒光檢測結果。20 mM Tris pH 9,NaCl在20 min內從50增加 ?250 mM,流速0.4 mL/min。

圖2. 使?優化的AEX?法定量各種AAV8空?殼和完整?殼混合物中的空?殼百分?。


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A. 

UV檢測結果:由于260 nm處病毒DNA的吸光度高于衣殼蛋白,280 nm處衣殼蛋白吸光度高于DNA,所以完整衣殼在260 nm處的峰面積大于280 nm處,而空衣殼在260 nm處的峰面積小于260 nm處;

B. 

同樣的分離方法下,熒光信號遠高于UV檢測信號;

C. 

使用從緩沖液pH值、鹽類型、緩沖液類型和鎂離子濃度等方面優化的AEX分離方法后監測AAV8樣品中的空衣殼/完整衣殼,得到較好的線性結果。


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體積排阻色譜法(SEC)
  • XBridge Premier GTx BEH SEC色譜柱,450?,2.5 μm,4.6 x 150 mm(圖片部件號:186010584

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圖3. 分別使用流速0.6 mL/min(2.5 μm顆粒,5分鐘分析時間,黑色曲線)的XBridge Premier GTx BEH SEC 450 ? 2.5 μm柱;和流速0.05 mL/min(5 μm顆粒,50分鐘分析時間,紅色曲線)的參考500 ?柱所獲得的AAV2(A)、AAV9(B)、AAV5-空(C)和AAV5-滿(D)SEC色譜圖的放大視圖。

A. 

相比5 μm的色譜柱,XBridge Premier GTx BEH 450 ? 2.5 μm具有更高的柱效,使得AAV的分離進一步提升;

B. 

擁有MaxPeak HPS技術的XBridge Premier GTx BEH 450 ?色譜柱由于避免了次級作用力,分離結果重現性更高。


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反相液相色譜法

分離AAV載體中的衣殼蛋白(VP)

  • ACQUITY UPLC BEH C4, 1.7 μm, 300 ?, 2.1 ×100 mm蛋?分析專?柱(圖片部件號:186004496

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圖4. AAV8?殼蛋?分析?法開發。(A) 使?ACQUITY UPLC BEH C8?譜柱并以甲酸作為流動相改性劑得到的分離結果;(B) 使?相同的ACQUITY UPLC BEH C8?譜柱,以DFA作為流動相改性劑得到的分離結果;(C) 使?ACQUITY UPLC BEH C4?譜柱并以DFA作為流動相改性劑,分離度有所提升。梯度:(A) 流動相A在32 min內從70%降? 62%;(B) 流動相A在16 min內從67%降?63%;(C) 流動相A在16 min內從68%降?64%。流速:0.2 mL/min。

A. 

相較于甲酸等傳統的流動相添加劑,二fu乙酸更有利于各衣殼蛋白的色譜分離,同時保持**的MS靈敏度;

B. 

對比130 ?的C18,孔徑為300 ?的C4使得VP1、VP2得到進一步分離,峰寬更窄,MS響應進一步提高。


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親水作用色譜

分離AAV載體中的衣殼蛋白(VP)

  • ACQUITY UPLC Amide糖蛋白分析專用柱, 300 ?, 1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm(圖片部件號:186007963)

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圖5. 使用以下兩款 LC 色譜柱分離AAV6、AAV7和AAV8 衣殼病毒蛋白(VP)所得的譜圖對比:(a) Waters ACQUITY UPLC Amide糖蛋白分析專用柱(300 ?, 1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm)和(b)Waters ACQUITY BEH C4色譜柱(300 ?, 1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm)。在λem = 280 nm 和λex = 348 nm 波長下監測熒光強度(EU),且所有樣品的熒光強度都經過歸一化處理。FD的譜峰歸屬根據準確質量數測定結果做了確認,標示如下:Ox:氧化;P:磷酸化。

ACQUITY BEH Amide色譜柱、ACQUITY BEH C4色譜柱在相同的離子對試劑(0.1%TFA v/v),且單位時間流動相B的變化也相同(%B/min)條件下分離三種不同AAV血清型的衣殼蛋白。結果表明ACQUITY BEH Amide色譜柱可以更好地分離VP變體。


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